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哺乳动物跨膜蛋白承担各种生物功能，在疾病的发生、发展过程中扮演重要角色。膜蛋白样品的制备需要充分考虑到与下游的胶分析及质谱分析等应用配套，因此膜蛋白样本制备成为一个难以逾越的挑战。传统制备膜蛋白样品的方法是使用去污剂和表面活性剂增溶。

去污剂处理会使膜蛋白丧失其天然结构，因而妨碍了膜蛋白的功能研究。

双向电泳膜蛋白提取试剂盒提供全套试剂，适用于从细胞和动物组织提取双向电泳用膜蛋白样品。提取过程简单方便，可在1小时内完成。提取的膜蛋白不仅纯度高，保持天然活性，而且绝少交叉污染。提取的蛋白可直接用于双向电泳蛋白研究。

• 使用方便，从细胞，组织中提取蛋白不需经过研磨、反复冻融、超声破碎等前处理。
  
• 将蛋白提取的时间缩短至30分钟～1小时。
  
• 含蛋白稳定剂，提取的蛋白稳定。
  
• 紫外检测蛋白浓度时，背景干扰低。
  
• 蛋白酶抑制剂抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制剂配方优化。蛋白酶抑制剂混合物包含7种独立的蛋白酶抑制剂；每一种抑制剂可特异性抑制某一种或几种蛋白酶活性。该混合物优化的组成使其可以抑制几乎所有重要的蛋白酶活性，包括丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、丙氨酰-氨基肽酶等。

• 旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。
  
• 实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。
  
• 蛋白酶抑制剂储存期间溶液如果出现沉淀，不影响使用，溶解后正常使用。
  
• 可以根据自己实验需要加入其它蛋白酶抑制剂单品。

• 细胞蛋白提取
  
  • 取5～10×10⁶个以上细胞，在4℃，500×g条件下离心2～3分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞。
    注：
    ● 细胞数量根据实验情况调整，每次的裂解液用量并不是一定的，请根据实际情况调整。
    ● 由于膜蛋白含量较少，需要较多的细胞才能保证得率。
    
  • 用冷PBS洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。
    
  • 细胞样品中加入200μL冷试剂A，2μL蛋白酶抑制剂混合物，高速涡旋振荡15秒，置冰上10～15分钟。
    
  • 再次高速涡旋振荡5秒，然后在4℃，13000×g条件下离心5分钟。
    
  • 快速将上清吸入另一预冷的干净离心管，37℃水浴5～10分钟，37℃下1000×g力离心3分钟，此时溶液分为两层（对着光线看），下层是膜蛋白部分约为20μL。
    注：必需保证在37℃左右下离心，至少确保30℃以上。无可控温的离心机时，用常温的离心机在室温离心即可，适当缩短离心时间至2～3分钟。
    
  • 移除上层溶液和界面层，收集下层膜蛋白样品。一般可直接跳过步骤7和步骤8直接进行步骤9，如果对膜蛋白样品纯度要求极高，可以进行步骤7或者步骤7和8，此时膜蛋白回收率会稍有降低。
    
  • 用150～200μL冰冷的试剂B稀释下层膜蛋白样品，混匀后冰浴2min，37℃水浴5～10分钟，37℃下1000×g力离心3分钟，此时溶液分为两层（对着光线看），下层是膜蛋白部分约为20μL。
    注：必需保证在37℃左右下离心，至少确保30℃以上。无可控温的离心机时，用常温的离心机在室温离心即可，适当缩短离心时间至2～3分钟。
    
  • 按步骤7再次抽提有机相(此步骤可以选做)。
    
  • 用80～150μL试剂C稀释下层膜蛋白样品。
    
  • 将上述蛋白提取物分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。
• 组织蛋白提取
  
  • 取适量组织样本剪碎，加冷PBS，用组织匀浆器匀浆至无明显肉眼可见固体（或用液氮研磨），冰上静置5分钟，小心将匀浆吸入另一预冷的干净离心管。
    
  • 在4℃，500×g条件下离心2～3分钟，弃上清。
    
  • 按照细胞蛋白的提取方法的第3步骤往下操作即可。
    
  • 上述蛋白提取物请分装后于-80℃冰箱保存备用。